Laboratorio di ecologia molecolare applicata ai parassiti marini

 

Attività

Il laboratorio studia principalmente l’ecologia molecolare di base applicata alla parassitologia, atta all’identificazione e successiva filogenesi di specie di nematodi anisakidi appartenenti a generi differenti (Anisakis, Contracaecum, Pseudoterranova).
Le ricerche mirano ad ampliare le conoscenze relative alle specie stesse di parassiti, sia per la loro esatta identificazione a livello di specie (es. presenza di complessi di specie), sia in relazione alle specie ospiti intermedie e/o definitive che intervengono nel complesso ciclo biologico di tali nematodi.labPara
In quest’ultimo caso, la ricerca verte a coadiuvare altri settori di interesse, tanto a livello commerciale, come nel caso di pesci con una elevata rilevanza dal punto di vista del mercato ittico (es. identificazione di stock ittici), quanto a livello di patologia clinica, come in presenza di casi di Anisakiasi umana (Anisakis spp. come agenti eziologiche nell’uomo).

Strumenti e tecniche

Estrazione del DNA

1- Kits di estrazione
2 – Estrazione con metodo CTAB:
a) Reagenti: CTAB, Proteinasi K, Phenolo-Chloroformio, Chloroformio, Etanolo assoluto e al 70%, TE (PH=8).
b) Strumentazione: set micropipette (0,1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl), cappa chimica, bagnetto termostatato, agitatore orbitale, centrifuga 24 posti per microtubi da 1,5 ml e 0,2 µl (adattatori), pompa a vuoto, termo-block, vortex.
3-Estrazione di DNA da paraffina/formalina:
a) Reagenti: xylene, etanolo assoluto e al 75%, PBS, Lysis buffer (proteinasi K, Tris-HCl, EDTA 0,5M, SDS 10%, acqua ultrapura), Phenolo-Chloroformio, Chloroformio, sodio acetato 3M, isopropanolo, TE (PH=8).
b) Strumentazione: set micropipette (0,1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl), bagnetto termostatato, centrifuga 24 posti per microtubi da 1,5 ml e 0,2 µl (adattatori), pompa a vuoto, termo-block, vortex.

Amplificazione DNA mediante PCR
Preparazione Master Mix: reagenti (acqua ultrapura, MgCl2, 5x buffer, dNTP, primers, DMSO, Taq Polimerasi, DNA totale), microtubi da 1,5 ml e 0,2 µl, racks.
Amplificazione: 2 termociclatori da 25 posti (microtubi da 0,2 µl).

Controllo post-PCR
-Preparazione gel (1%): TBE 0,5M, agarosio, GelRed solution, bilancia tecnica, beuta 500ml, cilindro graduato 100ml, forno microonde, vaschetta per colata gel, pettini (16 e 20 pozzetti).
-Corsa su gel: cella elettroforetica orizzontale (per gel fino a 20 pozzetti), alimentatore.
-Controllo gel: reagenti (colorante 6x loading-dye, marcatore di peso), set micropipette, rack, trans-illuminatore raggi UV (70 e 100%), analizzatore digitale di immagini, PC e stampante.
-Conservazione prodotti di PCR: frigorifero, scatole portaprovette-PCR.

Altra strumentazione: 1 frigorifero (+4 C°), 2 frigo-congelatore (-20 C°), 1 frigo-congelatore (-80 C°) e 1 frigo-congelatore (-40 C°).
Il laboratorio è inoltre dotato di 2 postazioni di lavoro, una postazione per la preparazione del mix per PCR, una postazione post-PCR per il trattamento dei prodotti di amplificazione, una postazione per la preparazione del gel di agarosio, una postazione per la corsa elettroforetica ed una postazione per l’acquisizione delle immagini (PC + stampante).

Staff

Prof.ssa Simonetta Mattiucci
Dott. Paolo Cipriani
Dott.ssa Michela Paoletti
Dott. Mauro Zampiglia

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